Masalah Umum HPLC (4)

21 Agustus 2026

Masalah dan Solusi Umum (Bagian 1)

Tekanan balik kolom memerlukan perhatian khusus selama operasi HPLC. Tekanan balik yang stabil berkaitan erat dengan kualitas bentuk puncak, efisiensi kolom, kinerja pemisahan, dan waktu retensi. Tekanan balik yang stabil bukan berarti nilai tetap yang konstan; melainkan, kisaran fluktuasi tekanan harus berada dalam 345 kPa atau 50 PSI. Variasi tekanan yang halus dan lambat dapat diterima dalam elusi gradien. Tekanan yang terlalu tinggi maupun terlalu rendah dianggap sebagai kesalahan yang berkaitan dengan tekanan.

01 Kenaikan Tekanan Mendadak

Hal ini umumnya disebabkan oleh penyumbatan di dalam jalur aliran. Lakukan pemecahan masalah secara bertahap sebagai berikut:

(1) Lepaskan port masuk pompa vakum. Tabung PEEK diisi dengan cairan. Posisikan tabung PEEK di bawah botol reservoir pelarut dan amati apakah cairan menetes dengan bebas. Jika cairan tidak menetes atau menetes sangat lambat, filter masuk pelarut tersumbat.

LarutanRendam filter dalam asam nitrat 30% selama setengah jam, lalu bilas hingga bersih dengan air ultra murni. Jika cairan menetes dengan bebas, filter saluran masuk pelarut normal; lanjutkan ke pemeriksaan berikutnya.

(2) Lepaskan fitting saluran masuk kolom. Jika tekanan tidak turun secara signifikan, katup injeksi enam port tersumbat. LarutanLakukan pembilasan pada katup enam port. Jika tekanan kembali normal, lanjutkan pemecahan masalah.

(3) Lepaskan ujung keluaran kolom. Jika tekanan tetap tinggi, kolom HPLC tersumbat.

Larutan:

- Untuk penyumbatan yang disebabkan oleh garam penyangga: bilas dengan air 95% hingga tekanan kembali normal.

- Untuk penyumbatan yang disebabkan oleh zat yang tertahan kuat: bilas dengan pelarut fase gerak yang lebih kuat daripada fase gerak kerja saat ini hingga tekanan stabil.

Jika tekanan tidak kunjung turun setelah pembilasan lama dengan pelarut di atas, sambungkan kembali saluran masuk dan keluar kolom pada instrumen dan bilas dengan fase gerak. Jika pembilasan balik masih tidak dapat menurunkan tekanan, penggantian frit saluran masuk kolom dapat dipertimbangkan. Catatan: Penanganan yang tidak tepat dapat dengan mudah menurunkan efisiensi kolom, jadi tindakan ini harus digunakan dengan hemat. Ganti kolom HPLC jika masalah berlanjut.

Pengaturan laju aliran tidak tepat: atur ulang ke laju aliran yang benar.
Komposisi fase gerak yang tidak tepat: rasio fase gerak yang berbeda menghasilkan koefisien viskositas yang berbeda. Fase gerak dengan viskositas lebih tinggi menghasilkan tekanan sistem yang lebih tinggi. Jika memungkinkan, beralihlah ke pelarut dengan viskositas lebih rendah atau sesuaikan kembali rasio fase gerak.
Penyimpangan titik nol tekanan sistem: kalibrasi ulang titik nol sensor tekanan.

02 Peningkatan Tekanan Bertahap

Peningkatan tekanan secara bertahap biasanya disebabkan oleh kontaminasi kolom, yang diakibatkan oleh penggunaan jangka panjang atau adsorpsi sampel.

LarutanLakukan pembilasan balik kolom dengan isopropanol murni pada kecepatan 0,2 mL/menit selama 12 jam. Amati apakah tekanan menurun. Jika tekanan turun, sambungkan kembali kolom ke arah maju dan lakukan pembilasan dengan metanol murni pada kecepatan 0,2 mL/menit selama 2 jam untuk sepenuhnya menggantikan sisa isopropanol. Kolom kemudian dapat dikembalikan ke operasi normal.

03 Tekanan Rendah

Penyebab paling sering adalah kebocoran sistem. LarutanPeriksa semua sambungan, terutama fitting di kedua ujung kolom kromatografi; kencangkan sambungan yang bocor. Lepaskan kolom dan kencangkan fitting dengan torsi yang sesuai atau pasang ferrule PTFE.
Gelembung udara terperangkap di dalam pompa. Gejalanya seringkali berupa tekanan yang tidak stabil dan berfluktuasi; terperangkapnya udara secara parah dapat mencegah pompa menarik fase bergerak.
LarutanBuka katup pembuangan dan bilas dengan laju 3-5 mL/menit. Jika masalah masih berlanjut, keluarkan gelembung udara secara manual melalui katup pembuangan menggunakan jarum suntik.
Tidak ada aliran keluar fase bergerak: verifikasi volume fase bergerak dalam wadah pelarut, pastikan filter saluran masuk pelarut terendam dalam cairan, dan periksa status pengoperasian pompa.