Referensi Laboratorium Utama: Rentang Penyesuaian yang Diizinkan untuk HPLC & GC dalam ChP, USP, Ph.Eur.

Farmakope nasional menyediakan metode uji standar untuk pekerjaan laboratorium rutin. Meskipun tampaknya berisi ketentuan yang ketat dan membatasi, penyesuaian tertentu diperbolehkan. Artikel ini membahas rentang penyesuaian yang diperbolehkan untuk pengujian kromatografi yang ditentukan dalam beberapa farmakope yang umum dirujuk.

Farmakope Cina
Fase Diam: Sifat fisikokimia bahan pengemas tidak boleh dimodifikasi, termasuk bahan substrat, modifikasi permukaan, dan fase terikat. Peralihan dari partikel berpori penuh ke partikel berpori permukaan diperbolehkan jika kondisi di atas terpenuhi.
Ukuran Partikel (dp) dan Panjang Kolom (L): Setelah mengubah ukuran partikel atau panjang kolom, nilai L/dp (atau nilai iV) harus berada dalam rentang -25% ~ +50% dari nilai semula.
Laju Aliran: Jika diameter dalam kolom atau ukuran partikel pengemas diubah, hitung laju aliran menggunakan rumus yang sesuai.
[Rumus dihilangkan]
Penyesuaian lebih lanjut dapat dilakukan sesuai dengan tekanan sistem dan waktu retensi aktual. Pada elusi isokratik, laju aliran dapat disesuaikan hingga ±50%. Pada elusi gradien, penyesuaian hanya boleh mengikuti rumus; rentang penyesuaian yang lebih luas tidak diperbolehkan.
Volume Injeksi: Sesuaikan untuk memenuhi persyaratan kesesuaian sistem. Jika dimensi kolom dimodifikasi, hitung volume injeksi melalui rumus yang sesuai dan lakukan penyesuaian berdasarkan persyaratan sensitivitas.
[Rumus dihilangkan]
Program Elusi Gradien: Pertahankan kelipatan volume elusi yang identik untuk kolom dengan spesifikasi berbeda untuk memastikan profil gradien yang konsisten. Perhitungkan perbedaan volume penahanan sistem di berbagai instrumen.
[Rumus dihilangkan]
Rasio Fase Seluler:
Elusi isokratik: Komponen fase gerak minor dapat disesuaikan dengan nilai relatif ±30% atau nilai absolut ±2%, mana pun yang memberikan besaran yang lebih besar. Proporsi komponen minor ini harus kurang dari (100/n)%, di mana n = jumlah komponen fase gerak.
Elusi gradien: Rasio komponen fase gerak dapat disesuaikan secara moderat untuk memenuhi kriteria kesesuaian sistem. Kekuatan elusi komposisi fase gerak akhir tidak boleh lebih lemah daripada gradien awal.
Konsentrasi Garam Buffer Fase Bergerak: Dapat disesuaikan dalam rentang ±10%.
Suhu Kolom: Kecuali dinyatakan lain, ±10 °C untuk elusi isokratik; ±5 °C untuk elusi gradien.
Nilai pH: Kecuali dinyatakan lain, pH komponen fase gerak berair dapat disesuaikan dalam rentang ±0,2 unit pH.
Panjang Gelombang Deteksi: Tidak diperbolehkan melakukan modifikasi.
Catatan:
F1 = laju aliran yang ditentukan dalam monograf; F2 = laju aliran yang disesuaikan
dc1 = diameter dalam kolom asli; dc2 = diameter dalam kolom yang disesuaikan
dp1 = ukuran partikel kemasan asli; dp2 = ukuran partikel kemasan yang disesuaikan
L1 = panjang kolom asli; L2 = panjang kolom yang disesuaikan
Vinj1 = volume injeksi asli; Vinj2 = volume injeksi yang disesuaikan
tG1 = waktu gradien asli; tG2 = waktu gradien yang disesuaikan
Farmakope Amerika Serikat
pH Larutan Penyangga Fase Bergerak (HPLC): Sesuaikan dalam ±0,2 unit pH atau dalam rentang yang ditentukan; berlaku untuk elusi isokratik dan gradien.
Konsentrasi Garam Buffer Fase Bergerak (HPLC): ±10% (asalkan pH tetap dapat diterima); berlaku untuk elusi isokratik dan gradien.
Rasio Komponen Fase Gerak (HPLC): Untuk komponen yang menyumbang ≤50% dari volume fase gerak, penyesuaian relatif ±30% diperbolehkan. Namun, penyesuaian absolut dari setiap komponen tunggal tidak boleh melebihi ±10% dari total komposisi fase gerak. Untuk fase gerak terner, sesuaikan setiap komponen secara individual; untuk fase gerak biner, penyesuaian berlaku untuk komponen minor. Contoh untuk sistem biner dan terner ditunjukkan di bawah ini:
Contoh biner 1: Rasio fase gerak 50:50. Perubahan relatif 30% untuk komponen 50% sama dengan 15%, yang melebihi batas komposisi absolut ±10%. Oleh karena itu, penyesuaian dibatasi hingga ±10% absolut; rentang yang diizinkan: 40:60 ~ 60:40.
Contoh biner 2: Rasio fase gerak 2:98. Perubahan relatif 30% untuk komponen minor 2% sama dengan 0,6%, yang sesuai dengan batas komposisi absolut ±10%. Rentang yang diizinkan: 1,4:98,6 ~ 2,6:97,4.
Contoh ternary: Rasio fase gerak 60:35:5. Perubahan relatif 30% untuk komponen 35% menghasilkan 10,5%, melebihi batas komposisi absolut ±10%, sehingga penyesuaian untuk komponen ini dibatasi hingga ±10% absolut. Perubahan relatif 30% untuk komponen minor 5% menghasilkan 1,5%. Rentang penyesuaian yang dapat diterima: 50:45:5 ~ 70:25:5 atau 58,5:35:6,5 ~ 61,5:35:3,5.
Panjang Gelombang Deteksi UV (HPLC): Panjang gelombang yang tercantum dalam monograf tidak dapat diubah. Berdasarkan spesifikasi produsen detektor atau data validasi terpisah, kesalahan pengukuran panjang gelombang tidak boleh melebihi ±3 nm.
Fase Diam:
Panjang Kolom (GC): Dapat disesuaikan dalam rentang ±70 %.
Panjang Kolom (HPLC): Lihat bagian ukuran partikel.
Diameter Dalam Kolom (HPLC): Diizinkan jika kecepatan linier dipertahankan; lihat bagian laju aliran HPLC.
Diameter Dalam Kolom (GC): Penyesuaian maksimum ±50 %.
Ketebalan Film (kolom GC kapiler): Dapat disesuaikan dari −50 % hingga +100 %.
Ukuran Partikel (HPLC): Baik ukuran partikel maupun panjang kolom dapat dimodifikasi. Rasio L/dp harus tetap konstan atau berada dalam rentang −25% ~ +50% relatif terhadap nilai referensi. Untuk partikel berpori permukaan, kombinasi alternatif panjang kolom (L) dan ukuran partikel (dp) dapat diterima asalkan jumlah pelat teoritis (N) berada dalam rentang −25% ~ +50% dibandingkan dengan kolom referensi.
Perlu dicatat bahwa jumlah pelat teoritis yang lebih tinggi menghasilkan volume puncak yang lebih kecil. Oleh karena itu, sumber pelebaran puncak di luar kolom (misalnya, tabung, volume sel detektor, frekuensi pengambilan sampel, volume injeksi) harus dioptimalkan. Jika ukuran partikel tidak ditentukan dalam monograf, hitung L/dp menggunakan ukuran partikel maksimum kolom referensi.
Ukuran Partikel (GC): Ukuran partikel dapat ditingkatkan atau dikurangi asalkan persyaratan kesesuaian sistem terpenuhi dan rasio rentang ukuran partikel (diameter partikel maksimum ÷ diameter partikel minimum) tetap tidak berubah.
Laju Aliran (GC): Dapat disesuaikan hingga ±50 %.
Laju Aliran (HPLC): Laju aliran harus dihitung ulang ketika ukuran partikel berubah; kolom partikel yang lebih kecil memerlukan kecepatan linier yang lebih tinggi untuk mempertahankan kinerja. Korelasikan laju aliran, diameter dalam kolom, dan ukuran partikel melalui rumus yang ditentukan.
[Rumus dihilangkan]
Untuk elusi isokratik: Ketika ukuran partikel berubah dari ≥3 μm menjadi ＜3 μm, tingkatkan kecepatan linier (dengan menyesuaikan laju aliran) untuk mencegah kehilangan efisiensi kolom lebih dari 20%. Sebaliknya, ketika ukuran partikel berubah dari ＜3 μm menjadi ≥3 μm, kurangi kecepatan linier (laju aliran) untuk menghindari kehilangan efisiensi kolom melebihi 20%.
Untuk elusi gradien: Penyesuaian laju aliran, diameter dalam kolom, dan ukuran partikel tidak diperbolehkan.
Selain itu, penyesuaian laju aliran ±50% hanya berlaku untuk elusi isokratik.
Catatan:
F1 = laju aliran yang ditentukan dalam monograf; F2 = laju aliran yang disesuaikan
dc1 = diameter dalam kolom asli; dc2 = diameter dalam kolom yang disesuaikan
dp1 = ukuran partikel kemasan asli; dp2 = ukuran partikel kemasan yang disesuaikan
Farmakope Eropa
Kromatografi Cair — Elusi Isokratik
Komposisi Fase Bergerak: Komponen minor dapat disesuaikan dengan toleransi relatif ±30% atau toleransi absolut ±2%, mana pun yang nilainya lebih besar.
Nilai pH Fase Gerak: Kecuali dinyatakan lain dalam monograf, pH fase gerak yang disiapkan dapat disesuaikan dalam ±0,2 unit pH relatif terhadap nilai atau rentang yang ditentukan. Untuk analit yang tidak dapat terionisasi (netral), pH dapat disesuaikan dalam ±1,0 unit pH.
Konsentrasi Garam Buffer: Konsentrasi garam dalam larutan buffer berair yang digunakan untuk persiapan fase gerak dapat disesuaikan dalam kisaran ±10 %.
Laju Aliran: Rentang penyesuaian umum ±50%. Jika dimensi kolom diubah, penyesuaian yang lebih besar diperbolehkan; hitung menggunakan rumus yang diberikan.
[Rumus dihilangkan]
Parameter Kolom
Fase Stasioner: Sifat-sifat fase stasioner tidak boleh diubah (misalnya C8 tidak dapat menggantikan C18).
Ukuran Partikel: Dapat dikurangi hingga 50%; peningkatan tidak diperbolehkan.
Panjang Kolom: Dapat disesuaikan dalam rentang ±70 %.
Diameter Dalam Kolom: Dapat disesuaikan dalam rentang ±25 %.
Suhu Kolom: Kecuali dinyatakan lain, dapat disesuaikan dalam rentang ±10 °C relatif terhadap suhu yang dinyatakan.
Panjang Gelombang Deteksi: Tidak diperbolehkan melakukan modifikasi.
Volume Injeksi: Dapat dikurangi jika sensitivitas puncak dan pengulangan memuaskan; peningkatan tidak diperbolehkan.
Kromatografi Cair — Elusi Gradien
Penyesuaian kecil pada komposisi fase gerak/program gradien diperbolehkan jika semua persyaratan berikut terpenuhi:
Persyaratan kesesuaian sistem terpenuhi;
Waktu retensi puncak utama berada dalam rentang ±15% dari waktu retensi awal;
- Kekuatan elusi dari komposisi fase gerak akhir tidak lebih lemah daripada gradien aslinya.
Jika kesesuaian sistem tidak dapat dicapai, selidiki efek volume tinggal atau pertimbangkan untuk mengganti kolom.
Volume Penahanan: Konfigurasi instrumen sangat memengaruhi resolusi, waktu retensi, dan waktu retensi relatif; volume penahanan yang berlebihan merupakan penyebab umum penyimpangan. Monograf sering kali menyertakan penahanan isokratik sebelum memulai gradien. Karena volume penahanan berbeda antara instrumen pengembangan metode dan instrumen penggunaan praktis, durasi gradien harus memadai. Pengguna harus memverifikasi waktu penahanan isokratik selama konfirmasi metode.
Apabila volume tinggal ditentukan dalam monograf, titik waktu elusi awal (t _min ) harus diganti dengan titik waktu yang disesuaikan (t _cmin ), yang dihitung dengan rumus yang diberikan.
[Rumus dihilangkan]
Di mana:
D = volume diam (mL); D₀ = volume diam selama pengembangan metode (mL); F = laju aliran (mL/menit).
Jika validasi metode tidak mencakup langkah ini, deskripsi isocratic-hold untuk tujuan ini dapat dihilangkan.
Nilai pH Garam Penyangga: Tidak diperbolehkan penyesuaian.
Konsentrasi Garam Penyangga: Tidak diperbolehkan penyesuaian.
Laju Aliran: Penyesuaian dapat diterima ketika diameter dalam kolom berubah; lihat rumus laju aliran.
[Rumus dihilangkan]
Parameter Kolom
Fase Stasioner: Sifat-sifat fase stasioner tidak boleh diubah (misalnya C8 tidak dapat menggantikan C18).
Ukuran Partikel: Tidak diperbolehkan melakukan penyesuaian.
Panjang Kolom: Dapat disesuaikan dalam rentang ±70 %.
Diameter Dalam Kolom: Dapat disesuaikan dalam rentang ±25 %.
Suhu Kolom: Kecuali dinyatakan lain, dapat disesuaikan dalam rentang ±5 °C relatif terhadap suhu yang dinyatakan.
Panjang Gelombang Deteksi: Tidak diperbolehkan melakukan modifikasi.
Volume Injeksi: Dapat dikurangi jika sensitivitas puncak dan pengulangan memuaskan; peningkatan tidak diperbolehkan.
Catatan:
F1 = laju aliran yang ditentukan dalam monograf; F2 = laju aliran yang disesuaikan
dc1 = diameter dalam kolom asli; dc2 = diameter dalam kolom yang disesuaikan
L1 = panjang kolom asli; L2 = panjang kolom yang disesuaikan
Kromatografi Gas
Parameter Kolom
Ukuran Partikel Fase Diam (kolom isian): Dapat dikurangi hingga 50%; peningkatan tidak diperbolehkan.
Ketebalan Film (kolom kapiler): Dapat disesuaikan dari −50 % ~ +100 %.
Panjang Kolom: Dapat disesuaikan dalam rentang ±70 %.
Diameter Dalam Kolom: Dapat disesuaikan dalam rentang ±50 %.
Laju Aliran: Dapat disesuaikan dalam rentang ±50 %.
Suhu Kolom: Dapat disesuaikan dalam rentang ±10% relatif terhadap nilai yang ditentukan.
Volume Injeksi dan Rasio Pembagian: Penyesuaian diperbolehkan asalkan persyaratan sensitivitas puncak dan pengulangan terpenuhi.